腫瘤免疫醫治在臨床醫治腫瘤過程當中顯示出的偉大潛力,使其成爲腫瘤醫治研討範疇的後起之秀,已慢慢發展爲繼手術、放療和化療以後的第四大醫治辦法。

說三大經典療法過時不免難免太傲慢,但這一後浪切實其實來勢洶洶,一大量研討者爲之沸騰。以後國際核心繞腫瘤免疫微情況停止腫瘤免疫療法的摸索研討此起彼伏且亮點頻出。

在腫瘤免疫研討過程當中,體外構建腫瘤免疫研討模子來驗證腫瘤免疫研討戰略的有用性,並摸索其內涵機制,是必弗成少的一個研討環節。在浩瀚腫瘤免疫研討模子中,運用最爲普遍的體外研討模子,是免疫細胞與腫瘤細胞共造就模子。

因為脾髒是機體最大的免疫器官,含有大批的淋巴細胞和巨噬細胞,是機體細胞免疫和體液免疫的中心,是以本文將以脾細胞爲例,具體引見若何將脾細胞與腫瘤細胞(MDA-MB-231)停止共造就並展開腫瘤免疫研討的初步試驗。

手把手教你展開免疫細胞與腫瘤細胞共造就試驗

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該試驗的流程圖如圖1所示,總共分爲三個部門:

1

小鼠脾細胞的提取分別造就

C57BL/6小鼠(6~8周)頸椎脫臼處逝世,敏捷放入75%乙醇(v/v)浸泡5分鍾,掏出,置于超淨台內的無菌造就皿中;

留意:前面壹切操作均在超淨台內完成,堅持無菌操作。

用鑷子夾起小鼠腹部皮膚,在小鼠左腹側中部剪開小口,扯開皮膚,便可見白色長條狀脾髒;

用鑷子悄悄提起脾髒,用眼科剪分別脾髒上面的結締組織,掏出脾髒,放入盛有5 mL RPMI1640造就基的無菌造就皿中;

將脾髒用眼科剪悄悄剪碎後,置于200目標細胞篩網上,用10 mL打針器針芯悄悄研壓脾髒,擠壓完成後,汲取大批RPMI1640造就基沖刷細胞篩網,將脾細胞懸液沖刷至造就皿中;

留意:此步調中所用的鑷子與步調3中的鑷子離開應用。10 mL打針液針芯采取一次性無菌包裝的打針器;

用無菌移液管汲取造就皿中的脾細胞懸液,放入50 mL無菌離心管中;

4℃前提下300×g離心5 min,去上清,參加5 mL紅細胞裂解液,用移液管悄悄奏樂平均後,室溫下裂解2分鍾(堅持悄悄振搖),參加15 mLPBS混勻,4℃前提下300×g離心5 min後棄上清,用PBS洗2遍,搜集細胞,用RPMI1640完整造就基(含10%FBS,下同)重懸細胞;

用RPMI1640完整造就基調劑細胞濃度爲5.0×106 cells/mL,備用。

2

CFDA-SE標誌MDA-MB-231細胞

取5 μL10 mM的CFDA-SE貯備液參加5 mL PBS配制成10 μM的CFDA-SE溶液;

留意:前面壹切步調盡可能避光操作。

搜集胰卵白酶消化的MDA-MB-231細胞,200×g離心5 min,PBS清洗細胞3次,將離心獲得的細胞團用1 mL PBS重懸然後參加1 mL的10 μM的CFDA-SE溶液,室溫下孵育8 min並稍微震動;

留意:搜集MDA-MB-231細胞後要用PBS將血清成份清洗去除,以避免影響前面CFDA-SE對細胞的染色效力。

孵育停止後,參加10 mL的RPMI 1640完整造就基,悄悄奏樂平均,以終止CFDA-SE染色;

200×g離心5 min,去上清,並用PBS清洗細胞2次;

用RPMI 1640完整造就基重懸並計數;

用RPMI 1640完整造就基調劑細胞濃度爲1×105 cells/mL,備用。

3

脾細胞與CFDA-SE標誌的MDA-MB-231細胞共造就

在12孔板內參加0.5 mL 1×105 cells/mL的CFDA-SE標誌的MDA-MB-231細胞與0.5 mL 5.0×106 cells/mL的脾細胞,搖擺平均後,放入細胞造就箱內停止共造就4小時;

造就停止後,賜與分歧濃度的腫瘤免疫調理藥物,放入細胞造就箱內孵育24小時;

留意:因為脾細胞是半懸浮細胞狀況,是以在賜與藥物時應采用直接參加藥物溶液的方法,不克不及先吸棄孔內的造就基。

孵育停止後,將孔內的造就基搜集至離心管內,貼壁的MDA-MB-231細胞采取胰卵白酶消化後,搜集細胞至離心管內;

采取細胞凋亡PI染色試劑盒內的緩沖溶液洗濯細胞一次(離心300×g,5 min),加過量的緩沖溶液重懸細胞;

采取細胞凋亡PI染色試劑盒內的PI染色液停止染色,室溫避光染色10 min;

手把手教你展開免疫細胞與腫瘤細胞共造就試驗

流式測定剖析,CFDA-SE+/PI+的細胞比例即爲免疫調理藥物安慰脾細胞施展抗腫瘤免疫效應後殺逝世的腫瘤細胞比例(圖2)。由圖2可見,在不加免疫調理藥物時,因為腫瘤細胞的自覺凋亡和脾細胞的免疫殺傷感化,腫瘤細胞的凋亡比例爲9.3%,而加了免疫調理藥物後,腫瘤細胞的凋亡比例明顯上升至30.3%。